本發明一般涉及采用免疫細胞療法治療自身免疫性疾病的方法。本發明一般還涉及可以在免疫細胞療法之前對受試者實施的淋巴細胞耗竭預調理方案。

背景技術：

1、根據美國國立衛生研究院的數據，在美國有超過2350萬人患有自身免疫性疾病。自身免疫性疾病是由于人體免疫系統攻擊健康細胞或組織導致的一組疾病。在自身免疫性疾病(其中b細胞發揮了引發或維持疾病的作用)的情況下，患者的b細胞的某些群體分化成抗體分泌細胞，抗體分泌細胞產生針對正常組織和細胞的抗體。雖然這些自身抗體是這類疾病的效應物，但根本病因是缺陷型b細胞，其錯誤地分化成分泌這些致病抗體的細胞。

2、目前對自身免疫介導的疾病的治療選擇涉及通過皮質類固醇、免疫抑制藥物和生物制劑實現的全身性免疫抑制。最常見的是，在慢性和急性基礎上使用皮質類固醇以控制疾病，并通過多種機制起作用以控制或下調多種炎癥途徑。在許多情況下，添加全身性免疫抑制藥物，如霉酚酸酯、硫唑嘌呤和甲氨蝶呤，以期盡量減輕癥狀并控制患者預期的復發。大多數治療自身免疫性疾病的療法都不是治愈性的，并且需要長期施用，通常持續患者的終生。此外，接受長期免疫抑制療法的患者有嚴重和危及生命的感染風險。因此，這些患者的醫療需求在相當大的程度上沒有得到滿足。

3、在過去的十年期間，嵌合抗原受體(car)?t細胞療法已經成為多種癌癥的既定治療方法。該方法在血液學惡性腫瘤如急性成淋巴細胞白血病(all)和彌漫性大b細胞淋巴瘤(dlbcl)中取得了特別的成功。一般來說，用于治療癌癥的car?t細胞療法涉及自人體血液分離t細胞，對細胞進行基因工程改造以表達針對所需靶抗原的car，對患者實施淋巴細胞耗竭化療預調理方案，并隨后對患者施用工程改造的car?t細胞，從而使car?t細胞靶向并破壞表達這種抗原的癌細胞。淋巴細胞耗竭預調理已經被認為是癌癥患者的car?t細胞療法的不可或缺的一部分，并且已經證明這種預調理方案增強了所施用的car?t細胞的存活性、持久性和功效，方式例如是通過提高穩態細胞因子如il-7和il-15的水平，以及通過消除競爭所述細胞因子的內源性免疫細胞，從而為輸注的細胞增殖創造更有利的環境(nissani等人(2021)?j.?immunother.?cancer?9:?e001743)。

4、最近，還研究了car?t細胞療法作為用于難治性系統性紅斑狼瘡(sle)的治療方法，這是一種b細胞介導的自身免疫性疾病。研究人員報告稱，實施car?t細胞療法在5名中度至重度難治性sle患者中誘導了5名的臨床緩解(mackensen等人(2022)?nat.?med.?28:2124-2132)。在這項研究中，患者在car?t細胞療法之前接受淋巴細胞耗竭預調理方案，包括總劑量為75?mg/m2的氟達拉濱(第-5、-4和-3天為25?mg/m2)和總劑量為1,000?mg/m2的環磷酰胺(第-3天為1,000?mg/m2；mackensen，同上)。在抗合成酶綜合征(肌炎)患者的病例研究中報道了類似的發現(muller等人(2022)?lancet?401:?815-818)。兩項研究中都沒有研究稱獲得成功的治療結果要求預調理方案。

5、雖然淋巴細胞耗竭預調理被認為是治療癌癥的工程改造t細胞療法中的重要步驟，但尚不清楚實現用t細胞療法成功治療自身免疫性疾病所需的淋巴細胞耗竭預調理的程度和強度。因此，盡管到目前為止已經取得了進展，但仍然需要開發新的和有用的治療方法來治療自身免疫性疾病。

技術實現思路

1、雖然在工程改造的免疫細胞療法中已經采用預調理方案用于治療癌癥，但考慮到癌癥受試者的潛在死亡率，強勁的預調理方案被認為對患者構成的風險是可接受的。然而，自身免疫性疾病通常不會像癌癥一樣構成迫在眉睫的致命風險。因此，適合治療癌癥的預調理治療可能不適合于治療自身免疫性疾病患者，因此這類預調理治療的相關風險可能是患者及其醫師無法接受的。現在已經發現，當采用免疫細胞療法治療自身免疫性疾病時，使用較低劑量的預調理藥劑是有效的，而不會構成與對癌癥患者使用較高劑量的藥劑相關的風險。本文所述的預調理方案與標準的預調理方案相比可利用劑量減少的環磷酰胺，和/或可基本上由一個或多個劑量的環磷酰胺組成，意外地發現，所述預調理方案將內源性免疫細胞的水平降低到足以實現用免疫細胞療法成功治療自身免疫性疾病的程度，同時將通常與標準預調理方案相關的毒性和風險降至最低。

2、因此，在一方面，本公開提供了治療有需要的受試者的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：(a)對所述受試者實施基本上由100-1,500?mg/m2/天的一個或多個劑量的環磷酰胺組成的預調理方案；并且(b)對所述受試者施用治療有效量的工程改造的car免疫細胞，其中所述受試者在步驟(b)之前不少于三天接受環磷酰胺。在某些實施方案中，預調理方案包括對所述受試者施用總劑量小于1,000?mg/m2的環磷酰胺。在某些實施方案中，環磷酰胺的一個或多個劑量是100-800?mg/m2/天。

3、在另一方面，本公開提供了治療有需要的受試者的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：(a)對所述受試者實施包括100-800?mg/m2/天的一個或多個劑量的環磷酰胺的預調理方案；對所述受試者施用治療有效量的工程改造的car免疫細胞，其中所述預調理方案包括對所述受試者施用總劑量小于1,000?mg/m2的環磷酰胺。在某些實施方案中，受試者在步驟(b)之前不少于三天接受環磷酰胺。

4、在另一方面，本公開提供了治療有需要的受試者的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：(a)對所述受試者實施包括100-1,500?mg/m2/天的一個或多個劑量的環磷酰胺的預調理方案；并且(b)對所述受試者施用治療有效量的工程改造的car免疫細胞，其中所述工程改造的car免疫細胞包含編碼car的核酸，其中所述car包含細胞外抗原結合位點，所述細胞外抗原結合位點包含重鏈可變結構域(vh)和輕鏈可變結構域(vl)，所述重鏈可變結構域包含互補決定區cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述輕鏈可變結構域包含互補決定區cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述cdrh1、cdrh2和cdrh3分別包含seq?id?no：1、2和3的氨基酸序列，并且所述cdrl1、cdrl2和cdrl3分別包含seq?id?no：5、6和7的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述car進一步包含跨膜結構域、共刺激結構域和細胞內信號傳導結構域。在某些實施方案中，受試者在步驟(b)之前不少于三天接受環磷酰胺。在某些實施方案中，預調理方案包括對所述受試者施用總劑量小于1,000?mg/m2的環磷酰胺。在某些實施方案中，環磷酰胺的劑量為100-800?mg/m2/天。

5、在前述方法的某些實施方案中，環磷酰胺的一個或多個劑量為1,000?mg/m2/天。

6、在任何前述方法的某些實施方案中，環磷酰胺的一個或多個劑量為750?mg/m2/天、500?mg/m2/天、375?mg/m2/天或250?mg/m2/天。

7、在任何前述方法的某些實施方案中，在步驟(b)之前三天與七天之間給受試者施用環磷酰胺。在某些實施方案中，在步驟(b)之前三天給受試者施用環磷酰胺。

8、在某些實施方案中，預調理方案包括在步驟(b)之前三天和四天對所述受試者施用環磷酰胺或基本上由在步驟(b)之前三天和四天對所述受試者施用環磷酰胺組成。在某些實施方案中，環磷酰胺的一個或多個劑量為500?mg/m2/天、375?mg/m2/天或250?mg/m2/天。

9、在某些實施方案中，預調理方案包括在步驟(b)之前三天、四天和五天對所述受試者施用環磷酰胺或基本上由在步驟(b)之前三天、四天和五天對所述受試者施用環磷酰胺組成。在某些實施方案中，環磷酰胺的劑量為250?mg/m2/天。

10、在任何前述方法的某些實施方案中，在步驟(b)之前的五天期間不給所述受試者施用氟達拉濱。在某些實施方案中，在步驟(b)之前的七天期間不給所述受試者施用氟達拉濱。

11、在前述方法的某些實施方案中，氟達拉濱不作為預調理方案的一部分施用。在某些實施方案中，不給所述受試者施用氟達拉濱。

12、在某些實施方案中，預調理方案是表1中公開的方案。

13、在任何前述方法的某些實施方案中，工程改造的car免疫細胞的治療有效量介于1x?105個細胞/kg與1?x?108個細胞/kg之間，例如介于1?x?106個細胞/kg與1?x?107個細胞/kg之間。在某些實施方案中，所述工程改造的car免疫細胞表達特異性結合b細胞表面抗原(例如cd19)的car。

14、在前述方法的某些實施方案中，工程改造的car免疫細胞包含編碼car的核酸，其中所述car包含：(i)包含抗原結合位點的細胞外結構域；(ii)跨膜結構域；(iii)共刺激結構域；和(iv)細胞內信號傳導結構域。在某些實施方案中，所述抗原結合位點包含重鏈可變結構域(vh)和輕鏈可變結構域(vl)，所述重鏈可變結構域包含互補決定區cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述輕鏈可變結構域包含互補決定區cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述cdrh1、cdrh2和cdrh3分別包含seq?id?no:?1、2和3的氨基酸序列，并且所述cdrl1、cdrl2和cdrl3分別包含seqid?no:?5、6和7的氨基酸序列。

15、在前述方法的某些實施方案中，所述抗原結合位點是人源化的或完全人的。在某些實施方案中，vh和vl包含分別與seq?id?no:?4和8的氨基酸序列為至少95%?(例如，至少95%、96%、97%、98%、99%或99.5%)同一的氨基酸序列。在某些實施方案中，vh和vl分別包含seqid?no:?4和8的氨基酸序列。在某些實施方案中，抗原結合位點存在于scfv中，例如其中所述scfv包含seq?id?no:?9的氨基酸序列。

16、在某些實施方案中，car的跨膜結構域包含cd8α鏈跨膜結構域，例如包含seq?idno:?19的氨基酸序列的cd8α鏈跨膜結構域。在某些實施方案中，car的共刺激結構域包含4-1bb細胞內結構域，例如包含seq?id?no:?20的氨基酸序列的4-1bb細胞內結構域。在某些實施方案中，car的細胞內信號傳導結構域包含cd3ζ信號傳導結構域，例如包含seq?id?no:21的氨基酸序列的cd3ζ信號傳導結構域。在某些實施方案中，car進一步包含插入在抗原結合位點與跨膜結構域之間的鉸鏈結構域或接頭，例如cd8α鏈鉸鏈，例如包含seq?id?no:?22的氨基酸序列的cd8α鏈鉸鏈。在某些實施方案中，car包含seq?id?no:?23的氨基酸序列。

17、在任何前述方法的某些實施方案中，所述自身免疫性疾病是b細胞介導的自身免疫性疾病，例如選自系統性紅斑狼瘡(sle)、尋常型天皰瘡(pv)、重癥肌無力(mg)、肌炎和膜性腎病變的自身免疫性疾病。在某些實施方案中，所述自身免疫性疾病選自狼瘡性腎炎、具有抗dsdna抗體的sle、粘膜型pv、粘膜皮膚型pv、musk相關mg、achr?mg、抗合成酶綜合征、皮肌炎和免疫介導的壞死性肌病變。在某些實施方案中，所述自身免疫性疾病是sle。

18、在任何前述方法的某些實施方案中，所述car免疫細胞是car?t細胞或car?nk細胞。在某些實施方案中，所述car免疫細胞是car?t細胞。

19、在另一方面，本公開提供了治療有需要的受試者的自身免疫性疾病的方法，其中所述方法包括施用包含編碼car的核酸的工程改造的免疫細胞，其中所述car包含：(i)包含結合cd19的抗原結合位點的細胞外結構域；(ii)跨膜結構域；(iii)共刺激結構域；和(iv)細胞內信號傳導結構域；其中所述抗原結合位點包含重鏈可變結構域(vh)和輕鏈可變結構域(vl)，所述重鏈可變結構域包含互補決定區cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述輕鏈可變結構域包含互補決定區cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述cdrh1、cdrh2和cdrh3分別包含seq?id?no:?1、2和3的氨基酸序列，并且所述cdrl1、cdrl2和cdrl3分別包含seq?id?no:?5、6和7的氨基酸序列。

20、在某些實施方案中，所述抗原結合位點是人源化的或完全人的。在某些實施方案中，vh和vl包含分別與seq?id?no:?4和8的氨基酸序列為至少95%?(例如，至少95%、96%、97%、98%、99%或99.5%)同一的氨基酸序列。例如，在某些實施方案中，vh和vl分別包含seq?id?no:4和8的氨基酸序列。在某些實施方案中，抗原結合位點存在于scfv中，例如其中所述scfv包含seq?id?no:?9的氨基酸序列。

21、在某些實施方案中，所述跨膜結構域包含cd8α跨膜結構域，例如包含seq?id?no:19的氨基酸序列的cd8α跨膜結構域。在某些實施方案中，所述共刺激結構域包含4-1bb細胞內結構域，例如包含seq?id?no:?20的氨基酸序列的4-1bb細胞內結構域。在某些實施方案中，所述細胞內信號傳導結構域包含cd3ζ信號傳導結構域，例如包含seq?id?no:?21的氨基酸序列的cd3ζ信號傳導結構域。在某些實施方案中，car進一步包含插入在抗原結合位點與跨膜結構域之間的鉸鏈結構域或接頭，例如其中所述鉸鏈結構域是cd8α鏈鉸鏈，例如包含seq?id?no:?22的氨基酸序列的cd8α鏈鉸鏈。在某些實施方案中，car包含seq?id?no:?23的氨基酸序列。

22、在前述方法的某些實施方案中，所述免疫細胞是t細胞或nk細胞。在某些實施方案中，所述免疫細胞是t細胞，例如輔助t細胞、記憶t細胞、αβ?t細胞或γδ?t細胞。在某些實施方案中，以藥物組合物的形式對受試者施用所述免疫細胞，其中所述藥物組合物進一步包含藥學上可接受的載劑或賦形劑。在前述方法的某些實施方案中，所述方法包括以1?x?105個細胞/kg與1?x?108個細胞/kg之間的劑量(例如以1?x?106個細胞/kg與1?x?107個細胞/kg之間的劑量)對受試者施用工程改造的免疫細胞。

23、在某些實施方案中，所述自身免疫性疾病是b細胞介導的自身免疫性疾病，例如選自系統性紅斑狼瘡(sle)、尋常型天皰瘡(pv)、重癥肌無力(mg)、肌炎和膜性腎病變的自身免疫性疾病。在某些實施方案中，所述自身免疫性疾病選自狼瘡性腎炎、具有抗dsdna抗體的sle、粘膜型pv、粘膜皮膚型pv、musk相關mg、achr?mg、抗合成酶綜合征、皮肌炎和免疫介導的壞死性肌病變。在某些實施方案中，所述自身免疫性疾病是sle。

24、在以下具體實施方式和權利要求中描述本公開的這些及其它方面和特征。