本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及一種生產(chǎn)復(fù)蘇促進(jìn)因子rpf的基因工程菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、復(fù)蘇促進(jìn)因子(resuscitation?promoting?factor，rpf)是由細(xì)菌自分泌或旁分泌的一類可以促進(jìn)休眠菌復(fù)蘇和生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。該因子最初在藤黃球菌?(micrococcusluteus)中發(fā)現(xiàn)，除能促進(jìn)休眠菌的復(fù)活和生長(zhǎng)外，對(duì)正常生長(zhǎng)的細(xì)菌也有效，其機(jī)制可能是參與了細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及核磁共振分析顯示，其具有一個(gè)高度保守且由70個(gè)左右氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)域，對(duì)促進(jìn)生長(zhǎng)具有重要意義，即rpf樣結(jié)構(gòu)域。之后在其它革蘭氏陽(yáng)性菌中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了與此蛋白作用相似，同樣具有rpf樣結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，組成rpf蛋白家族。

2、中國(guó)發(fā)明專利cn109402032b公開了一種生產(chǎn)復(fù)蘇促進(jìn)因子rpfe的基因工程菌及其應(yīng)用，以嗜聯(lián)苯紅球菌tg9的基因組dna為模板，通過pcr擴(kuò)增rpfe基因；將pcr產(chǎn)物與表達(dá)載體peasy-blunt?e1連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒peasy-blunt-rpfe，隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌獲得基因工程菌。該種方法構(gòu)建的基因工程菌提取的重組蛋白純度和酶活性均較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)復(fù)蘇促進(jìn)因子rpf的基因工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌提取的重組蛋白純度和酶活性較高。

2、本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)復(fù)蘇促進(jìn)因子rpf的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌屬于原核生物，所述基因工程菌的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，該序列為將藤黃微球菌（micrococcus?luteus）野生型細(xì)菌復(fù)蘇促進(jìn)因子（resuscitation-promotingfactor,?rpfwt）原始核苷酸序列（z96935.2:920-1591）經(jīng)過密碼子突變和dna序列優(yōu)化后獲得，將所述核苷酸序列命名為delta?rpf，所述原始核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4、seq?id?no.1：

5、atggataccatgaccctgtttaccaccagcgcaacccgtagccgccgtgcaacagcgagcattgtggcaggcatgaccctggcgggtgccgcagccgtgggctttagcgcgccggcacaggcggcgaccgttgatacctgggaccgcctcgccgaatgcgaatcaaatggtacctgggatatcaacacgggtaacggtttttacggtggcgttcaatttaccctgagcagctggcaggccgttggaggtgaaggctacccgcatcaggcgtcaaaagccgaacagatcaaacgtgccgaaatcctgcaagatctgcagggctggggcgcctggccgctatgtagtcagaaactgggtctgacccaggcggatgcagatgcaggcgatgtggatgccaccgaagccgcgccggtcgccgtcgaacgcaccgccaccgttcagcgtcagtcagccgcggatgaagccgcagcggaacaggcggcggcagcggagcaggccgtcgttgccgaagcggaaaccattgtcgttaaaagcggcgatagcctgtggaccctggcgaacgaatatgaagtggaaggtggctggaccgcgctgtacgaagcgaataaaggtgcagttagcgacgcggccgttatttatgcgggccaggaactggtgttaccgcaggcgtaa。

6、seq?id?no.2：

7、atggacaccatgactctcttcaccacttccgccacccgctcccgccgtgccaccgcctcgatcgtcgcgggcatgaccctcgccggcgccgccgccgtgggcttctccgccccggcccaggccgccaccgtggacacctgggaccgcctcgccgagtgcgagtccaacggcacctgggacatcaacaccggcaacggcttctacggcggcgtgcagttcaccctgtcctcctggcaggccgtcggcggcgaaggctacccgcaccaggcctcgaaggccgagcagatcaagcgcgccgagatcctccaggacctgcagggctggggcgcgtggccgctgtgctcgcagaagctgggcctgacccaggctgacgcggacgccggtgacgtggacgccaccgaggccgccccggtcgccgtggagcgcacggccaccgtgcagcgccagtccgccgcggacgaggctgccgccgagcaggccgctgccgcggagcaggccgtcgtcgccgaggccgagaccatcgtcgtcaagtccggtgactccctctggacgctcgccaacgagtacgaggtggagggtggctggaccgccctctacgaggccaacaagggcgccgtctccgacgccgccgtgatctacgtcggccaggagctcgtcctgccgcaggcctga。

8、進(jìn)一步的，所述基因工程菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢，保藏日期為2025年11月07日，保藏編號(hào)為cctcc?no:m?20252480,分類命名為大腸埃希氏菌pet32a-delta?rpf-bl21(de3)?escherichia?coli?pet32a-delta?rpf-bl21(de3)。

9、本發(fā)明還提供了上述生產(chǎn)復(fù)蘇促進(jìn)因子rpf的基因工程菌的應(yīng)用。

10、進(jìn)一步的，制備rpf重組蛋白，包括如下步驟：

11、s1、復(fù)蘇促進(jìn)因子delta?rpf基因的合成及基因工程菌的構(gòu)建；

12、s2、復(fù)蘇促進(jìn)因子delta?rpf基因工程菌的表達(dá)、純化；

13、s3、取步驟s2中所得的上清液進(jìn)行sds-page電泳分析；

14、s4、表達(dá)菌株的大量誘導(dǎo)與delta?rpf重組蛋白的純化；

15、s5、檢測(cè)delta?rpf重組蛋白的酶活力。

16、進(jìn)一步的，所述s5步驟中，用4-甲基傘形酮-n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷（4-muf-3-nag）作為底物，建立酶活性測(cè)定方法，用于檢測(cè)delta?rpf重組蛋白的酶活力。

17、進(jìn)一步的，所述建立酶活性測(cè)定方法，包括如下步驟：

18、s51、配制4-muf-3-nag工作液；

19、s52、測(cè)定delta?rpf重組蛋白的濃度與delta?rpf重組蛋白產(chǎn)量；

20、s53、稀釋delta?rpf重組蛋白，隨后加入所述4-muf-3-nag工作液，孵育，加入堿溶液，得到混合液；

21、s54、對(duì)所述混合液進(jìn)行酶活性的檢測(cè)。

22、進(jìn)一步的，所述s51中4-muf-3-nag工作液的配制具體包括：吡啶：水（1:1）的混合溶液溶解4-muf-3-nag，至4-muf-3-nag的濃度為5?mg/ml，得到4-muf-3-nag貯存溶液；

23、隨后使用檸檬酸鈉混合水溶液稀釋4-muf-3-nag貯存溶液濃度至16?μmol/l，得到4-muf-3-nag工作液。

24、進(jìn)一步的，所述檸檬酸鈉混合水溶液為：50mmol/l?檸檬酸鈉，5mmol/l?mgso4進(jìn)行混合，調(diào)整ph為6.0。

25、本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

26、本發(fā)明通過對(duì)藤黃微球菌delta?rpf氨基酸序列進(jìn)行突變，通過基因合成構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸埃希氏桿菌感受態(tài)細(xì)胞后構(gòu)建基因工程菌，進(jìn)而制備delta?rpf?重組蛋白，制備完成的delta?rpf重組蛋白呈可溶性表達(dá)，為后續(xù)檢測(cè)vbnc狀態(tài)腸炎沙門氏菌、vbnc狀態(tài)大腸埃希氏菌、vbnc狀態(tài)金黃色葡萄球菌、vbnc志賀氏菌和vbnc狀態(tài)李斯特氏菌等微生物奠定了良好研究基礎(chǔ)。經(jīng)親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化后，delta?rpf重組蛋白的純度可達(dá)93%，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)提取的蛋白純度。

27、本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌制備的delta?rpf重組蛋白酶活力顯著高于未突變的rpf蛋白酶活性。